Badania molekularne a białaczka

Aby zajrzeć w samo źródło białaczki, należy przyjrzeć się DNA jej komórek. Służą do tego badania molekularne, które odsłaniają przed nami tajemnice zapisane w kodzie genetycznym. Gdyby nie badania molekularne, niemożliwe byłoby skuteczne leczenie białaczek. To właśnie dzięki nim lekarz może dobrać odpowiednie metody terapii. Poznajemy również mechanizmy powstawania białaczki, co pozwala zrozumieć tą chorobę. W jaki sposób bada się DNA białaczek i jakie to niesie ze sobą korzyści?

Skąd się bierze białaczka?

Białaczka to nowotwór złośliwy. Przyczyną choroby jest uszkodzenie DNA komórki krwiotwórczej szpiku w taki sposób, że zaczyna się nadmiernie i nieustannie dzielić. To właśnie tych zmian w DNA poszukuje się, robiąc badania molekularne. DNA to chemiczny nośnik pamięci. Podobnie jak płyta CD czy dysk twardy DNA przechowuje zapisany w nim kod genetyczny. Ten kod decyduje nie tylko o charakterze komórki (jej wyglądzie i pełnionej funkcji), ale także kiedy i ile razy ma się podzielić. Odpowiadają za to onkogeny. Jeśli taki gen ulegnie mutacji zaburzającej jego funkcje - powstaje nowotwór.

Białaczka wywodzi się z białych krwinek. Są to komórki krwi, które powstają w szpiku i pełnią funkcję obronną. Wyróżnia się wiele rodzajów białych krwinek, co również jest zapisane w DNA. Do podstawowych rodzajów białych krwinek zalicza się:

• limfocyty B - odpowiedzialne za przeciwciała;
• limfocyty T - nadzorujące pracę innych komórek;
• makrofagi - komórki żerne;
• neutrofile - odpowiedzialne za walkę z bakteriami;
• oraz wiele innych rodzajów.

Badanie FISH

Istnieje wiele sposobów na podejrzenie DNA. Jednak w przypadku białaczek nie interesuje nas sekwencjonowanie całego kodu. Jest on tak długi, że udało się to zrobić tylko raz. Zajęło to parę lat i zostało nagrodzone Nagrodą Nobla. Aby zbadać tylko te fragmenty, które mogą być przyczyną choroby, wymyślono sprytne techniki znakowania molekularnego. Używa się ich właśnie w diagnostyce białaczki. Najbardziej rozpowszechnione i najczęściej stosowane są dwie: FISH oraz PCR.

FISH (ang. ryba) wbrew pozorom nie ma nic wspólnego z wędkowaniem. Jest to metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. Fluorescent In Situ Hybridization). Brzmi obco, ale w gruncie rzeczy to bardzo prosta technika. Służy określeniu położenia konkretnego genu lub genów w danym obszarze chromosomu. Dzięki temu jesteśmy w stanie określić, czy dany gen został przemieszczony (translokacja), odwrócony (inwersja) czy przecięty na dwa kawałki, które teraz znajdują się w przeciwnych końcach dwóch różnych chromosomów.

Jak to działa? Otóż DNA jest komplementarne. To znaczy, że nić pierwsza (zawierająca zapis danego genu) jest dokładnie odwzorowana w sposób lustrzany na drugiej nici (zawierającej fragment niekodujący). Ta właściwość DNA jest podstawą życia. Bowiem gdy rozerwie się podwójną helisę na dwie oddzielne nici, do każdej można dobudować komplementarną kopię. Dzięki temu komórki mogą się dzielić.

FISH wykorzystuje zjawisko, że nici łączą się tylko wtedy, gdy są komplementarne. Jeśli chcemy wyznakować jakiś gen, tworzymy krótką nić komplementarną do niego i łączymy ją chemicznie z barwnikiem fluorescencyjnym. Następnie wprowadzamy zawiesinę tych znaczników do komórki, którą chcemy zbadać (np. komórki białaczkowe). Następuje wiązanie komplementarnych nici a nadmiar znaczników się wypłukuje. Potem, oświetlając komórkę światłem lasera, możemy pod mikroskopem zobaczyć położenie wyznakowanych genów na chromosomie. Świecą one na zielono, niebiesko lub czerwono. Znając prawidłowe rozmieszczenie tych genów, możemy zobaczyć co się stało. Jaka mutacja doprowadziła do powstania białaczki i co za tym idzie, czy da się ją wyleczyć i w jaki sposób to zrobić.

Badanie PCR

Wynalezienie techniki PCR pozwoliło genetyce rozwinąć skrzydła. To właśnie dzięki tej metodzie wiemy obecnie tak wiele o mechanizmach stojących za powstawaniem białaczek i innych nowotworów. Zasada działania PCR jest bardzo prosta i prowadzi do nieskończonego powielania wybranego fragmentu DNA. Dzięki tej technice możemy nie tylko określić czy dany gen występuje w genomie, ale także czy w jego wewnętrznej strukturze zaszła jakaś zmiana (mutacja).

Zasada działania PCR jest bardzo prosta. Wykorzystuje to samo zjawisko komplementarności nici DNA co FISH. DNA składa się z nukleotydów G, C, T, A, czyli guaniny, cytozyny, tyminy i adeniny. Budowa chemiczna poszczególnych nukleotydów wymusza konkretne połączenia między komplementarnymi nićmi DNA. Jeśli w pierwszej nici występuje G, to w drugiej zawsze C a jeśli w nici pierwszej jest A, to w drugiej T i na odwrót. Tak więc, jeżeli rozłączymy dwie nici DNA i zanurzymy je w roztworze nukleotydów, to powstaną 4 komplementarne nici. Badanie PCR polega na tym, że w jednym pojemniku umieszcza się nukleotydy, DNA które chcemy pomnożyć oraz polimerazę DNA (enzym budujący DNA, który wytrzymuje wysoką temperaturę, mimo iż jest białkiem). Następnie powtarza się następujące cykle:

• próbówkę podgrzewa się do ponad 80 stopni tak, by obie nici DNA oderwały się od siebie;
• obniżamy temperaturę;
• polimeraza dobudowuje komplementarne nici i z dwóch robi cztery;
• znów podnosimy temperaturę.

Po każdym cyklu ilość nici DNA jest podwajana: 2, 4, 8, 16 etc., aż do wyczerpania zapasów nukleotydów.

Aby wyselekcjonować konkretny fragment DNA (np. gen białaczkowy, którego mutacje chcemy zbadać), dodaje się fragment komplementarny do tego genu. Jeśli PCR zajdzie, oznacza to że mutacja występuje. Jeżeli nie, szukany gen jest inny niż podany znacznik. Pozwala to bardzo precyzyjnie określić, jaka mutacja spowodowała wystąpienie białaczki i jaki dokładnie mechanizm stoi za namnażaniem się komórek.

Leczenie celowane

Można by zapytać po co to wszystko? Otóż opisane powyżej badania molekularne pozwalają rozpoznać i lepiej zrozumieć konkretne mechanizmy odpowiadające za powstawanie białaczki. Skutkuje to wytwarzaniem tzw. leków celowanych. Pierwszym i najbardziej spektakularnym zwycięstwem było stworzenie leku przeciwko przewlekłej białaczce szpikowej. Dzięki badaniom molekularnym możemy wyodrębnić tych chorych, u których za nowotworzenie odpowiada produkt zmutowanego genu BCR/ABL. To kinaza tyrozynowa - rodzaj enzymu. Imatinib natomiast jest lekiem blokującym tą kinazę. Wystarczy powiedzieć, że wprowadzenie imatinibu do podstawowej terapii pozwoliło osobom chorym na przewlekłą białaczkę szpikową wydłużyć życie z 2 do nawet > 10 lat od momentu rozpoznania, co w standardach onkologicznych uznawane jest za wyleczenie.

Badania molekularne w białaczkach stanowią podstawę doboru odpowiedniego leczenia. Dzięki nim powstają nowe leki celowane a te już dostępne są stosowane we właściwy sposób. Postęp jaki dokonał się w leczeniu nowotworów układu krwiotwórczego w dużej mierze zawdzięczamy rozwojowi technik diagnostyki molekularnej.


Bibliografia

Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Stokłosa T., Immunologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009, ISBN 978-83-01-15154-6
Srebniak M.I., Tomaszewska A. Badania cytogenetyczne w praktyce klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008, ISBN 978-83-200-3489-9
Lewiński A., Liberski P.P. (red.), Biologia molekularna człowieka, Czelej, Lublin 2006, ISBN 83-89309-64-5
Janicki K. Hematologia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001, ISBN 83-200-2431-5